走进尊龙凯时

NEWS

尊龙凯时慢病毒转染实操全攻略!

来源:沈刚丹 日期:2025-03-11

在之前的两期文章中,我们讨论了细胞转染以及慢病毒转染的基本知识。本期将进一步详细介绍慢病毒转染的实验步骤、注意事项以及常见问题,帮助大家理解和应用这一技术。

尊龙凯时慢病毒转染实操全攻略!

一、慢病毒实验步骤

慢病毒的实验流程通常包括以下几个步骤:质粒构建、病毒包装、病毒收集与浓缩、感染靶细胞,以及筛选与验证。

1. 质粒构建

首先,将外源目的基因片段插入到质粒载体中,以构建重组质粒。接着,将重组质粒在大肠杆菌中转化并提取重组质粒DNA。

2. 病毒包装

将重组质粒DNA与其他所需的包装质粒按一定比例共转染至293T细胞中,待48小时和72小时后分别收集含病毒上清液。

3. 病毒收集与浓缩

对收集到的病毒上清液进行3000rpm离心20分钟,过滤去除细胞沉淀。随后进行12000rpm的离心以初步浓缩,并将浓缩的病毒分装至-80°C贮存。必要时,可对病毒进行滴度测定。

4. 慢病毒转染细胞

实施慢病毒转染时,第一天应将293T细胞消化并计数,调整至合适的细胞密度,接种至24孔板中,并放入37℃、5% CO2的培养箱中。一般确保细胞汇合度在30%-50%以利于第二天的感染。

在第二天,轻轻吸去旧培养基,加入预热的新鲜完全培养液,然后继续培养。在此步骤中,部分孔可作为对照组不添加病毒。

转染后24小时,从显微镜下观察细胞状态,并记录。如果无异常,可用新鲜培养液替换含病毒的培养液,之后继续培养。

在接下来的几天中,可以观察转染效果,并依据结果对成功转染的细胞进行筛选。

二、慢病毒实验注意事项

在进行慢病毒转染时,需要注意以下几点:

  • 病毒的保存应当适当,短期可在4℃存放,长期需-80°C保存,并避免反复冻融。
  • 细胞状态要良好,应选择生长在对数期的细胞进行转染,以提高转染效率。
  • 接种量应根据细胞增殖速度和培养器皿大小来调整,保持适宜的密度。
  • 提前查找靶细胞的培养条件与参数,以优化实验条件。

三、实验常见问题

Q1:如何提高慢病毒对细胞的感染效率?
确保细胞状态良好,适当的细胞密度以及合适的感染条件至关重要。对于悬浮细胞,采用离心感染法可以有效提高感染效率。

Q2:转染后细胞死亡,该怎么办?
保持细胞状态良好,并确保感染条件适宜,灵活应对,并可考虑调整细胞状态再进行筛选。

Q3:目的基因如何整合到染色体?
无论是瞬时转染还是稳定转染,DNA均有可能随机整合到宿主染色体中。稳定转染使用了抗性基因便于筛选成功转染的细胞。

Q4:慢病毒转染时的细胞接种量是多少?
根据细胞增殖速度和培养容器的大小调整接种量,一般保持在20%-30%的汇合度,特殊情况下可适当增加。

尊龙凯时提供了广泛的慢病毒转染服务,覆盖多种细胞系与原代细胞,助您高效获取目标细胞。了解更多,请访问我们的官方网站,获取详细信息!

上一篇:了解尊龙凯时在质粒DNA、RNA、RNP非病毒系统递送CRISPR组分的优势与特点下一篇:新研究揭示尊龙凯时在糖尿病性骨质疏松症治疗中的潜在靶点

全国客户服务热线
17080373516 总部地址:武汉牧野区谌街道36号

欢迎关注尊龙凯时官方微信或拨打客服电话详询!

  

尊龙凯时官方微信