人胰腺癌细胞HPAFⅡ培养说明书

一、细胞培养条件

细胞名称：人胰腺癌细胞HPAFⅡ

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液

培养体系：MEM + 10% FBS + 1% 丙酮酸钠 + 1% L-谷氨酰胺 + 1% P/S

贴壁传代方法：第一次建议1:2传代

备注：用无菌离心管收集瓶中培养基，留作对比培养。如对比培养效果不佳，建议直接购买尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

细胞收到后，待培养至良好状态后，灌满完全培养液并封好瓶口是运输细胞的最佳方式。首先，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后放置于超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时，以确保细胞状态稳定，之后进行处理。显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照保存（最好在40x, 100x, 200x各拍一张），前三天的照片为售后重要依据，若不提供照片默认为收到状态良好。

(传代后建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基，以便进行对比培养，换液时将瓶盖稍微拧松)

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

当细胞未超过80%汇合度时，将瓶中完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基并放入37℃、5% CO2孵箱中。如果细胞密度超过80%，可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS对细胞进行1-2次洗涤。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后显微镜下观察细胞消化情况。若细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使之完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗细胞一次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，将培养瓶倒置后在显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打使其脱落。
3. 将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
4. 弃去上清液后，将沉淀细胞加入1ml尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
5. 将冻存的细胞直接放入-80℃冰箱，如果后续要转移至液氮罐中，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上再进行转移。

c、细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），迅速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶；然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清液后，将细胞沉淀用5ml完全培养基重悬，并接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。
4. 次日，及时更换为新鲜的完全培养基继续培养。

四、注意事项

某些细胞在贴壁时不够牢固，运输过程中可能发生细胞脱落，这属于正常现象。如果脱落较多，可将培养瓶中的所有培养液收集至离心管中，在1000rpm下离心5分钟，使用收集的上清液进行过渡培养。沉淀部分加入1-2ml胰酶并轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后，再加入5ml完全培养基终止反应，随后再次离心，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬，最后按1:2比例进行分瓶传代，补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO2培养箱中培养。

五、售后条款

1）细胞出现问题可重发的情况及判定标准：

1. 细胞运输过程中出现问题，如丢失、瓶身破损、严重漏液等，均可重发。
2. 若出现细胞污染问题，请在收到产品48小时内提供真实实验结果经核实后重发。
3. 常温发货细胞若在静置24小时后干冰冻存细胞复苏后24小时内，大多数细胞未存活，需提供真实清晰的细胞状态照片，可重发。
4. 干冰发货细胞复苏后24小时内或常温发货细胞静置4小时且未开封出现污染情况，均可重发。
5. 对于细胞活性问题，请在收到产品7天内提供真实实验结果，通过台盼蓝染色法鉴定细胞活力，经核实后将予以重发。
6. 收到细胞当天及第2、3天请拍照，若三天内未告知问题，视为产品合格。若4-7天内出现问题，提供前3天照片及处理步骤，经过技术人员确认若为我方责任，将予以重发。

2）细胞出现问题不予重发的情况：

1. 因客户造成的细胞污染，不予重发。
2. 客户因不正确操作致细胞状态欠佳，不予重发。
3. 因非本库推荐培养体系导致的细胞状态不良，不予重发。
4. 细胞状态差未提供培养前3天照片者，不予重发。
5. 细胞培养过程中经过其他处理的，不予重发。
6. 收到后2天内未及时告知，不予重发。
7. 具体问题需视情况而定。